L’objectif principal du projet est de développer un modèle original de jonction neuromusculaire in-vitro en 3D combinant les trois types cellulaires. Cela permettra de répondre à des questions fondamentales quant aux mécanismes physiopathologiques impliqués dans la CMT, mais aussi à plus long terme d’identifier des molécules thérapeutiques sur un modèle proche de la physiologie de l’individu atteint.
Ce projet repose sur la mise en commun de l’expertise spécifique de trois laboratoires de la Région Nouvelle Aquitaine : le laboratoire XLIM-UMR-CNRS7252 (Univ Limoges), qui développe, entre autre, des micro-puces par impression 3D qui vont permettre l’assemblage de ces types cellulaires ; le laboratoire PRéTI-UR24184-UFR SFA (Univ Poitiers), qui possède l’expertise de développement 2D et 3D des cellules musculaires in-vitro, dont des cellules dérivées d’hiPSCs, mais également des méthodes permettant les études fonctionnelles de ces modèles (imagerie calcique), et par des approches originales (optogénétique) ; le laboratoire UR20218 NeurIT (Univ Limoges), qui a mis en place la technologie d’hiPSC et leurs différenciations à Limoges. Des résultats préliminaires obtenus au laboratoire sur des cellules saines montrent que la co-culture motoneurones/cellules de Schwann favorise l’extension des prolongements neuronaux. Parallèlement à ces expériences, une collaboration avec l’équipe Mitolab UMR Inserm U1083-CNRS 6015 à Angers nous permettra de réaliser des expérimentations d’oxygraphie, de métabolomique et de lipidomique permettant de clarifier le rôle de GDAP1 dans cette pathologie.
Une fois ce modèle caractérisé sur cellules saines, cette culture complexe avec les trois types cellulaires sera appliquée à des cellules issues de patients pour comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la CMT au niveau de la jonction neuromusculaire, et pourra permettre d’identifier des alternatives pharmacologiques à plus long terme, en lien avec la Startup locale CURLIM.

L’amélioration de la santé humaine est un enjeu sociétal extrêmement important. Les maladies touchant l’Homme peuvent être innées (maladies génétiques héréditaires) ou acquises (dues à des facteurs extérieurs). Les neuropathies périphériques constituent un problème de santé publique majeur car on estime en France une prévalence de 700 000 personnes, qui restent, en l’absence de traitement pharmacologique efficace, dans l’impasse thérapeutique. Décrite en 1886, la neuropathie périphérique d’origine héréditaire la plus fréquente est la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) et a une prévalence dans la population de 1/2 500 soit environ 26 000 patients en France. Cette neuropathie périphérique est dite sensitivo-motrice, c’est-à-dire qu’elle va affecter aussi bien les capacités motrices d’un individu que ses capacités sensitives (Vallat et al, 2013). L’expressivité de cette maladie est très variable, allant de formes très sévères chez l’enfant, pouvant conduire à la mort, jusqu’à des formes peu sévères d’apparition tardive chez l’adulte (Lerat et al, 2017 et Lerat et al, 2019). Plus de 90 gènes ont été mis en évidence dans ces formes génétiques (Timmerman et al, 2014). Dans notre laboratoire, nous nous intéressons entre autres au gène GDAP1, dont les fonctions protéiques ne sont pas encore bien établies (Miressi et al, 2021). Il semblerait que cette protéine soit impliquée dans les interactions mitochondrie-réticulum endoplasmique, ou la mise en place du réseau mitochondrial voir dans la fusion/fission mitochondriales. Cependant, il faut noter que bien que ce gène soit présent dans toutes les cellules de l’organisme, les mutations de GDAP1 ne sont délétères que pour les motoneurones et/ou pour l’interaction Motoneurones / Cellules de Schwann / Cellules Musculaires. Malheureusement, ces nerfs sont impossibles à prélever dans leur totalité chez un individu, ce qui en complique l’étude, et les modèles animaux ou cellulaires disponibles ne représentent pas fidèlement la pathologie humaine. Afin de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués et de pouvoir tester des stratégies thérapeutiques, nous avons développé, au sein de notre laboratoire, la technologie innovante des cellules souches induites à la pluripotence (iPSC) (Faye et al, 2016 – 2020) afin d’obtenir des motoneurones issus à l’origine de fibroblastes de patient porteur d’une mutation délétère sur le gène GDAP1. Pour ce projet, nous nous focaliserons sur la création d’un modèle de tri-culture Motoneurones / Cellules de Schwann / Cellules Musculaires sur la base de notre expertise en culture cellulaire de Motoneurones ou de Cellules de Schwann ainsi que des modèles de CoCulture développés et maitrisés au laboratoire. La deuxième partie de ce projet sera d’étudier le rôle d’une mutation du gène GDAP1 au sein des motoneurones sur l’interaction avec les autres populations cellulaires d’intérêt grâce au modèle de coculture, et en particulier leur viabilité, transmission des signaux (neurotransmetteurs), structures lipidiques … et en perspectives de tester l’efficacité de molécules thérapeutiques actuellement à l’étude au sein du laboratoire. Ce projet permettra de mieux appréhender les mécanismes physiopathologiques intercellulaires responsables de neuropathie périphérique induite par une mutation non-sens sur un gène exprimé au niveau des motoneurones pour pouvoir développer à terme des approches thérapeutiques novatrices.

La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est la neuropathie périphérique héréditaire la plus fréquente chez l’humain. Elle touche les motoneurones (MN) et les cellules de Schwann (CS). La majorité des gènes impliqués, dont SH3TC2 et GDAP1, peuvent être affectés par des mutations non-sens. En 2021, peu de modèles cellulaires humains existaient, et aucun traitement curatif n’était disponible pour les patients. Les travaux de cette thèse se centre sur SH3TC2, responsable de la forme démyélinisante autosomique récessive la plus fréquente des CMT, nommée CMT4C ou AR-CMTde-SH3TC2 et sur GDAP1 notamment responsable d’une forme axonale AR-CMTax-GDAP1. Dans un premier temps, nous avons analysé une cohorte de 103 patients mutés sur SH3TC2 et montré que plus de 80 % des patients possédaient au moins un allèle avec une mutation non-sens, associé à une gravité clinique accrue. Nous avons également identifié 22 nouvelles mutations pathogènes sur ce gène. La seconde partie de ce travail a consisté à créer les premiers modèles cellulaires neuronaux humains pour SH3TC2. À partir de cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs) issues d’un individu contrôle, nous avons utilisé la technologie CRISPR-Cas9 pour produire, avec plus de 90% d’efficacité, deux modèles humains in vitro contenant des mutations non-sens induisant un codon stop prématuré (PTC) : un modèle homozygote p.(Arg954*) (PTC de type UGA) et un modèle homozygote p.(Gln71*) (PTC de type UAG). Ces hiPSCs contrôle et mutées ont ensuite été différenciées en CS. Nous avons mis en évidence une expression précoce de SH3TC2 dans les CS contrôle. Dans les modèles CS AR-CMTde-SH3TC2, une expression réduite de SH3TC2, un retard de maturation, une capacité réduite à soutenir les MN en coculture, et des anomalies dans le recyclage des récepteurs à la transferrine ont été observées. Enfin, nous avons testé plusieurs molécules thérapeutiques ciblant les mutations non-sens, des agents de translecture et des inhibiteurs du mécanisme de surveillance des ARN non-sens (NMDi). Sur un modèle de progéniteurs neuronaux dérivés d’hiPSCs portant la mutation homozygote non-sens p.(Ser194*) (UGA) sur GDAP1, nous avons testé une de ces molécules et montré qu’elle stabilisait l’ARNm muté GDAP1, restaurait son expression protéique et corrigeait la morphologie mitochondriale. Dans les modèles CS créés dans cette thèse pour SH3TC2, nos premiers résultats suggèrent l’effet positif de deux de ces molécules sur la réexpression de la protéine pour les deux types de codons UGA et UAG. Dans la quatrième partie de ce travail, nous avons développé un modèle 3D de coculture CS/MN permettant d’induire la myélinisation, étape ultime pour étudier les maladies démyélinisantes comme l’AR-CMTde-SH3TC2. Les molécules thérapeutiques identifiées pourront être testées sur ces modèles cellulaires de coculture et potentiellement in vivo pour évaluer leur capacité à induire une remyélinisation. Ce travail de thèse souligne l’importance des modèles cellulaires adaptés pour comprendre les mécanismes physiopathologiques de la CMT et ouvre des perspectives prometteuses pour de nouvelles approches thérapeutiques.

Les mutations non-sens générant un codon de terminaison prématuré (PTC) peuvent induire la production d’une protéine tronquée ou bien une dégradation prématurée de l’ARNm muté par le système NMD (Nonsense-Mediated mRNA Decay). Ces mutations non-sens sont la cause d’environ un tiers des maladies d’origine génétique et notamment de certaines neuropathies périphériques, dont la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT). Des mutations non-sens sur le gène GDAP1 ont été associées à des formes sévères de CMT. Le rôle cellulaire de GDAP1 reste encore mal défini. Au sein du laboratoire NeurIT, UR20218, de l’Université de Limoges, nous avons mis en place un modèle cellulaire de cellules neuronales (Progéniteurs neuronaux (PN) et Motoneurones (MN)) issues des cellules souches pluripotentes induites (iPSc) de contrôles et d’un patient CMT porteur de la mutation homozygote c.581C>G (p.Ser194*) sur le gène GDAP1. Dans un premier temps, nous avons caractérisé ce modèle neuronal et mis en évidence un stress oxydant associé à un dysfonctionnement mitochondrial dans les MN issus d’iPSc du patient. Dans un deuxième temps, après avoir réalisé une revue de la littérature sur les molécules de translecture et les inhibiteurs du NMD, nous avons testé certaines de ces molécules sur nos modèles neuronaux, en collaboration avec l’Institut Pasteur de Lille. Nous avons pu démontrer que la molécule « Amlexanox » stabilisait l’ARNm GDAP1 muté et activait l’expression protéique de GDAP1 dans les PN et les MN. D’un point de vue fonctionnelle, nous avons observé que ce traitement permet de restaurer la morphologie des mitochondries des PN. Dans une dernière partie de cette thèse, nous présentons l’identification d’un codon non-sens et d’une délétion partielle du gène SH3TC2, l’un des principaux gènes mutés dans les formes autosomiques récessives démyélinisantes de CMT. L’établissement de modèles neuronaux sur ce gène sont une perspective de ce travail de thèse. Les molécules thérapeutiques identifiées lors de cette thèse pourront être testées sur ces prochains modèles. Ce travail de thèse montre l’importance des modèles cellulaires adaptés pour comprendre les voies physiopathologiques impliquées dans la CMT et montre des résultats prometteurs en termes d’approche thérapeutique.

La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est la neuropathie périphérique héréditaire la plus fréquente. Actuellement plus de 80 gènes ont été identifiées comme étant à l’origine des CMT, mais le diagnostic génétique est posé seulement dans 30 à 40% des cas. Cette étude avait deux objectifs principaux : dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux CMT et neuropathies périphériques associées via une approche moléculaire et bioinformatique, pour optimiser leur caractérisation génétique ; dans un second temps, nous avons étudié les mécanismes altérés dans une forme axonale de CMT, par la création d’un modèle cellulaire humain de cellules souches humaines induites à la pluripotence (hiPSc) et leur différenciation en motoneurones (MN). Dans la première partie du projet, nous présentons un nouvel outil bioinformatique, CovCopCan, développé au sein de l’équipe pour détecter les Variations du Nombre de Copies (CNV), à partir des données de NGS. Grâce à CovCopCan, deux nouveaux CNV ont été identifiés et nous discutons leur implication dans deux cas complexes de neuropathie périphérique. Nos travaux ont également permis de mettre en évidence trois variations génétiques chez un patient CMT, soulignant que la CMT peut être une pathologie génétique multilocus. Dans la deuxième partie de ce travail, un modèle cellulaire de MN a été créé pour étudier le gène GDAP1 et son implication dans le CMT2H. Nous avons reprogrammé des fibroblastes dermiques de cinq sujets contrôles et de deux patients CMT, portant deux mutations codon-stop homozygotes sur le gène GDAP1, en cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). Nous avons ensuite mis au point un protocole de différenciation pour générer des MN à partir d’hiPSC. Les MN avec la mutation p.Ser194* sur GDAP1 ont été analysés par des tests fonctionnels, morphologiques et d’expression. Nous avons confirmé l’expression neuronale de GDAP1, et nous avons mis en évidence que le stress oxydant et la dysfonction mitochondriale étaient à l’origine de la pathologie dans les MN CMT2H. Nos résultats ont montré que les analyses génétique et fonctionnelle sont essentielles pour la caractérisation complète de la maladie de CMT.

Les cellules souches induites à la pluripotence (iPSc) apparaissent comme une solution très intéressante pour créer et observer le comportement de cellules spécifiques et inaccessibles d’un patient. Notre équipe travaille sur les pathologies génétiques des nerfs périphériques et en particulier la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT). Un de nos objectifs est le développement de modèles de motoneurones de patients utilisant la stratégie des iPSc afin de mieux comprendre la physiopathologie des neuropathies liées au gène GDAP1. Ce gène a été décrit en 1998 pour être responsable d’une forme axonale de CMT ; il code une protéine de la membrane externe mitochondriale dont la fonction précise reste encore méconnue. Des fibroblastes dermiques (FD) ont été obtenus après une biopsie de peau d’une personne saine (témoin) et d’un patient homozygote porteur de la mutation non-sens p.Gln163* dans le gène GDAP1. Par la suite, les FDs ont été reprogrammés en cellules iPSc en utilisant le cocktail de Yamanaka (plasmides non intégratifs composés d’Oct4, Sox2, Klf4 et l-Myc). Après amplification, tous les contrôles ont été effectués pour conclure que nos iPSc avaient les mêmes propriétés et les mêmes capacités que les cellules souches embryonnaires ainsi qu’un caryotype normal. Enfin, nous avons optimisé le protocole de différenciation avec succès de manière à obtenir à partir des iPSc des rosettes (structures pleines de progéniteurs neuronaux), puis des neurones et finalement des motoneurones pour le contrôle et le patient. Les premières différences entre le contrôle et le patient ont été observées lors de l’obtention de rosettes. Les cellules du patient présentaient de nombreuses gouttelettes lipidiques et la proportion de rosettes obtenue était plus faible. Une fois les motoneurones obtenus, des tests de microscopie confocale et électroniques ont montré des différences du réseau mitochondrial entre le témoin et le patient, ainsi qu’une morphologie des mitochondries se rapprochant de celle observée lors de biopsie de nerf de patient (rondes / accumulées). De manière à réduire la durée de différenciation, une méthode de tri cellulaire a été utilisée la SdFFF. Cette méthode nous a permis de trier différents progéniteurs (neuraux / endothéliaux). La génération de motoneurones à partir de fibroblastes dermiques de patient atteint de CMT axonale via les iPSc était une première étape cruciale pour mieux comprendre le rôle de GDAP1 dans cette pathologie. Ce modèle cellulaire de CMT4A est un premier pas pour réaliser des tests précliniques de médicaments afin d’identifier de futurs candidats pharmacologiques.