La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est la neuropathie périphérique héréditaire la plus fréquente chez l’humain. Elle touche les motoneurones (MN) et les cellules de Schwann (CS). La majorité des gènes impliqués, dont SH3TC2 et GDAP1, peuvent être affectés par des mutations non-sens. En 2021, peu de modèles cellulaires humains existaient, et aucun traitement curatif n’était disponible pour les patients. Les travaux de cette thèse se centre sur SH3TC2, responsable de la forme démyélinisante autosomique récessive la plus fréquente des CMT, nommée CMT4C ou AR-CMTde-SH3TC2 et sur GDAP1 notamment responsable d’une forme axonale AR-CMTax-GDAP1. Dans un premier temps, nous avons analysé une cohorte de 103 patients mutés sur SH3TC2 et montré que plus de 80 % des patients possédaient au moins un allèle avec une mutation non-sens, associé à une gravité clinique accrue. Nous avons également identifié 22 nouvelles mutations pathogènes sur ce gène. La seconde partie de ce travail a consisté à créer les premiers modèles cellulaires neuronaux humains pour SH3TC2. À partir de cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs) issues d’un individu contrôle, nous avons utilisé la technologie CRISPR-Cas9 pour produire, avec plus de 90% d’efficacité, deux modèles humains in vitro contenant des mutations non-sens induisant un codon stop prématuré (PTC) : un modèle homozygote p.(Arg954*) (PTC de type UGA) et un modèle homozygote p.(Gln71*) (PTC de type UAG). Ces hiPSCs contrôle et mutées ont ensuite été différenciées en CS. Nous avons mis en évidence une expression précoce de SH3TC2 dans les CS contrôle. Dans les modèles CS AR-CMTde-SH3TC2, une expression réduite de SH3TC2, un retard de maturation, une capacité réduite à soutenir les MN en coculture, et des anomalies dans le recyclage des récepteurs à la transferrine ont été observées. Enfin, nous avons testé plusieurs molécules thérapeutiques ciblant les mutations non-sens, des agents de translecture et des inhibiteurs du mécanisme de surveillance des ARN non-sens (NMDi). Sur un modèle de progéniteurs neuronaux dérivés d’hiPSCs portant la mutation homozygote non-sens p.(Ser194*) (UGA) sur GDAP1, nous avons testé une de ces molécules et montré qu’elle stabilisait l’ARNm muté GDAP1, restaurait son expression protéique et corrigeait la morphologie mitochondriale. Dans les modèles CS créés dans cette thèse pour SH3TC2, nos premiers résultats suggèrent l’effet positif de deux de ces molécules sur la réexpression de la protéine pour les deux types de codons UGA et UAG. Dans la quatrième partie de ce travail, nous avons développé un modèle 3D de coculture CS/MN permettant d’induire la myélinisation, étape ultime pour étudier les maladies démyélinisantes comme l’AR-CMTde-SH3TC2. Les molécules thérapeutiques identifiées pourront être testées sur ces modèles cellulaires de coculture et potentiellement in vivo pour évaluer leur capacité à induire une remyélinisation. Ce travail de thèse souligne l’importance des modèles cellulaires adaptés pour comprendre les mécanismes physiopathologiques de la CMT et ouvre des perspectives prometteuses pour de nouvelles approches thérapeutiques

Le syndrome de CANVAS définie un ensemble d’entités cliniques que sont l’ataxie cérébelleuse, la neuronopathie sensitive et l’aréflexie vestibulaire, responsable conjointement ou individuellement de différents symptômes dont le plus majoritaire est un trouble de l’équilibre. De façon intéressante, il est maintenant établi que la majorité des patients présentent, des dizaines d’années avant les troubles neurologiques, une toux chronique réfractaire. En 2019, la cause génétique de ce syndrome a été décrite. Elle intéresse le gène RFC1 au sein duquel une expansion biallélique de répétitions du pentanucléotide AAGGG situé dans l’intron 2 du gène a pu être mise en cause chez les patients cliniquement atteint. Ce motif AAGGG de grande taille remplace la conformation AAAAG classiquement répétée 11 fois en population générale. La cause physiopathologique responsable de cette maladie n’est pas encore connue. Plusieurs études ont montré une variabilité de la zone répétée qu’elles soient en termes de conformations du motif qu’en termes de nombre de répétitions. Leurs implications dans la pathologie ne sont pas toujours évidentes.Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à trois axes concernant ce syndrome : (a) décrire la variabilité de la zone répétée dans une cohorte de témoins et dans une cohorte de patients adressée pour neuropathie, (b) étudier histologiquement l’atteinte nerveuse périphérique en particulier celle des petites fibres nerveuses, non décrites antérieurement, (c) étudier la prévalence de l’expansion biallélique du pentanucléotide AAGGG dans une cohorte de patients tousseurs chroniques réfractaires.Nos résultats ont permis de mettre en évidence de nouveaux motifs répétés complexes à la fois chez des témoins mais aussi chez des patients avec neuropathie. L’atteinte des petites fibres nerveuses dans le CANVAS a pu être objectivée pour la première fois. Notre étude de cohorte de 68 patients tousseurs chroniques réfractaires a permis de mettre en évidence 16% des patients porteurs d’une expansion biallélique AAGGG pathogène et nous conduit à suggérer que la toux des patients CANVAS serait une toux neurogène.L’ensemble de ces résultats de thèse a permis une avancée dans les connaissances moléculaires et physiopathologiques du syndrome de CANVAS. Des travaux complémentaires permettront de comprendre les mécanismes physiopathologiques sous-jacents afin d’envisager in fine d’éventuelles thérapeutiques personnalisées.

Les neuropathies périphériques héréditaires (NPH) sont causées par des altérations génétiques entraînant des lésions des nerfs moteurs et/ou sensitifs. En 1991, la duplication de PMP22 a été décrite comme la première variation pathogène associée aux NPH. Aujourd’hui, grâce aux avancées des technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS), plus de 100 gènes ont été identifiés chez les patients présentant des NPH. Cependant, la majorité des variants détectés dans ces gènes sont des mutations ponctuelles ou de petites insertions ou délétions, tandis que les variants du nombre de copies (CNVs) sont rarement décrits. Dans cette étude, nous avons d’abord réalisé une analyse bioinformatique en utilisant le logiciel CovCopCan, permettant de détecter des CNVs sur des données de NGS. 62 CNVs ont été détectés chez 12% de notre cohorte de 765 patients présentant de symptômes de NPH. Ces CNVs ont été repartis au sein de 32 gènes associés aux NPH et nous avons caractérisé certains de ces CNVs au sein des gènes KIF5A, ATL3, SACS et SH3TC2. En outre, nous nous sommes concentrés sur un CNV de type délétion détecté dans SH3TC2, et nous avons développé un modèle cellulaire pour caractériser cette variation. À partir d’une biopsie cutanée d’un patient hétérozygote composite atteint de CMT4C, portant à la fois un CNV et une altération non-sens, des cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs) ont été créées. Ces hiPSCs ont été ensuite différenciées en cellules de Schwann afin d’explorer les mécanismes pathologiques conduisant au phénotype du patient. Dans l’ensemble, notre étude souligne l’importance d’étudier les CNVs pour améliorer le diagnostic des NPH et a permis de développer pour la première fois un modèle cellulaire adapté à l’étude d’un CNV de type délétion dans un gène impliqué dans les NPH de transmission autosomique récessive.

La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est la neuropathie périphérique héréditaire la plus fréquente. Actuellement plus de 80 gènes ont été identifiées comme étant à l’origine des CMT, mais le diagnostic génétique est posé seulement dans 30 à 40% des cas. Cette étude avait deux objectifs principaux : dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux CMT et neuropathies périphériques associées via une approche moléculaire et bioinformatique, pour optimiser leur caractérisation génétique ; dans un second temps, nous avons étudié les mécanismes altérés dans une forme axonale de CMT, par la création d’un modèle cellulaire humain de cellules souches humaines induites à la pluripotence (hiPSc) et leur différenciation en motoneurones (MN). Dans la première partie du projet, nous présentons un nouvel outil bioinformatique, CovCopCan, développé au sein de l’équipe pour détecter les Variations du Nombre de Copies (CNV), à partir des données de NGS. Grâce à CovCopCan, deux nouveaux CNV ont été identifiés et nous discutons leur implication dans deux cas complexes de neuropathie périphérique. Nos travaux ont également permis de mettre en évidence trois variations génétiques chez un patient CMT, soulignant que la CMT peut être une pathologie génétique multilocus. Dans la deuxième partie de ce travail, un modèle cellulaire de MN a été créé pour étudier le gène GDAP1 et son implication dans le CMT2H. Nous avons reprogrammé des fibroblastes dermiques de cinq sujets contrôles et de deux patients CMT, portant deux mutations codon-stop homozygotes sur le gène GDAP1, en cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). Nous avons ensuite mis au point un protocole de différenciation pour générer des MN à partir d’hiPSC. Les MN avec la mutation p.Ser194* sur GDAP1 ont été analysés par des tests fonctionnels, morphologiques et d’expression. Nous avons confirmé l’expression neuronale de GDAP1, et nous avons mis en évidence que le stress oxydant et la dysfonction mitochondriale étaient à l’origine de la pathologie dans les MN CMT2H. Nos résultats ont montré que les analyses génétique et fonctionnelle sont essentielles pour la caractérisation complète de la maladie de CMT.

Les neuropathies périphériques héréditaires (NP) sont caractérisées par des phénotypes très divers et une hétérogénéité génétique importante. La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) représente la majeure partie des neuropathies périphériques sensitivo-motrices. D’autres symptômes peuvent être associés, telle que la surdité. A l’heure actuelle, aucune estimation précise de la surdité n’existe dans cette population et la pathogénicité est incertaine. L’objectif de cette thèse était de mieux comprendre la physiopathologie de la surdité chez les patients atteints de neuropathies périphériques. Pour cela plusieurs approches complémentaires ont été mises en œuvre : 1) Approche clinique sur une cohorte française de patients atteints à la fois de neuropathie périphérique et de surdité et tests de génétique moléculaire avec séquençage NGS (Panels NP, surdités et/ou exomes) ; 2) Approche biochimique sur des prélèvements de nerfs cochléaires murins et humains ; 3) Approche bioinformatique afin d’identifier des réseaux de protéines impliquées dans l’apparition de surdité liée à une neuropathie périphérique. Grâce à ce travail, nous avons pu caractériser les phénotypes variés des patients atteints de NP génétique et surdité, et ainsi constater que la surdité peut être endo, rétro ou endo et rétrocochléaire. Trente-six gènes ont été rapportés comme associées à NP et surdité. Le génotype de nos patients NP+Surdité a pu être établi dans 60% des cas, avec la découverte de sept nouveaux variants pathogènes dans cinq gènes différents. Nos travaux suggèrent également que PMP22, le gène le plus retrouvé dans les CMT, n’est probablement pas ou peu impliqué dans l’apparition de la surdité des patients NP. Chez deux de nos patients présentant un variant pathogène de PMP22, un deuxième gène impliqué a été trouvé avec respectivement COCH et MYH14. Des corrélations génotypes-phénotypes ont pu être mises en évidence avec les gènes ABHD12, SH3TC2, NEFL et PRPS1. Deuxièmement, l’étude préliminaire immunohistochimique sur des nerfs auditifs de rats sauvages a permis de mettre en évidence l’expression de pmp22, mpz, nefl et trpv4 au niveau du nerf cochléaire et de pister une différence d’expression chez les rats CMTpmp22/+. L’étude chez l’humain n’a pas été concluante. Dernièrement, la recherche in silico de voies communes aux différents gènes décrits comme impliqués dans NP+surdité a permis de confirmer le lien direct entre PMP22 et MPZ. Des liens indirects entre plusieurs autres protéines ont été pistés. Cette thèse montre également que la surdité est très certainement sous-diagnostiquée dans cette population de NP génétique. Nous proposons donc un suivi audiométrique systématique des patients atteints de NP héréditaire, et une évaluation neurologique pour les enfants diagnostiqués pour surdité.

Des modifications du gène PMP22 (Peripheral Myelin Protein 22) sont responsables de neuropathies du système nerveux périphérique : l’Hypersensibilité à la Pression (HNPP : Hereditary Neuropathy with liability to Pressure Palsy) lorsqu’il est délété, CMT1A (Charcot-Marie-Tooth type 1A) lorsqu’il est dupliqué et CMT1E ou HNPP lors de mutations ponctuelles. Cependant, le rôle de la protéine PMP22 dans ces neuropathies demeure obscur. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux partenaires d’interactions potentiels de PMP22 : l’intégrine α6β4 (un récepteur des laminines), pourrait être impliqué dans le CMT1A. Dans cette étude, nous avons utilisé un modèle de rat transgénique portant des copies supplémentaires de PMP22 de souris. Chez ce modèle, nous avons mis en évidence des variations d’expression génique des intégrines, ainsi qu’une mauvaise localisation cellulaire de celles-ci. Ces variations des niveaux d’expression des intégrines sont les témoins d’un retard de la maturation des cellules de Schwann myélinisantes, expliquant la diminution de l’épaisseur des gaines de myéline, observée chez les rats CMT1A. Dans un second temps, nous avons étudié le cas particulier d’un patient sans expression de PMP22, en raison de deux mutations composites sur les deux allèles de PMP22. Nous avons observé que l’absence de PMP22 chez l’homme entraine une absence complète de myéline due à un blocage de l’initialisation de la myélinisation lors de la formation du mésaxone. Dans un troisième temps, nous avons effectué une étude comparative de modèles animaux et de patients atteints de CMT1A / 1E et d’HNPP permettant de valider l’utilisation de tels modèles dans l’étude de ses neuropathies. Enfin, nous nous sommes intéressés d’un point de vue informatique à la structure tridimensionnelle de différentes protéines dont PMP22 grâce à la dynamique moléculaire. Ce modèle tridimensionnel de PMP22 est le point de départ de l’étude des mutations ponctuelles ainsi que des interactions de PMP22 avec son environnement. Grâce aux animaux modèles et à l’étude de patients, nous avons montré le rôle indispensable de PMP22 dans l’initialisation de la myélinisation ainsi que son effet sur les intégrines dans le CMT1A. L’utilisation de modèles informatiques tridimensionnels créés de PMP22 permettra de comprendre les effets des mutations ponctuelles sur sa structure, et ses interactions.

La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est une pathologie neurologique affectant le système nerveux périphérique. Bien que décrite à la fin du XIXème siècle, la découverte d’une anomalie génétique n’a été identifiée chez ces patients que dans les années 1990 (duplication du gène PMP22). Depuis, de nombreux gènes ont été incriminés, et leur nombre ne cesse d’augmenter. Ainsi, cette multitude de gènes nous incite à rechercher des corrélations phénotype-génotype qui permettent d’orienter au mieux le diagnostic et la prise en charge de ces patients. Comme nous le montrons au travers de nos travaux, il est possible de s’appuyer sur des données cliniques, biologiques, électrophysiologiques (voire radiologiques) et histo-pathologiques (biopsie de nerf) pour orienter la recherche d’anomalies génétiques. Pour illustrer ceci, nous nous sommes appuyés sur l’exemple des mutations du gène INF2, gène récemment associé à la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Dans ce cas précis, l’atteinte rénale, le profil électrophysiologique (forme « intermédiaire » de CMT) et surtout les données histo-pathologiques (la biopsie de nerf permettant de retrouver la présence d’expansions schwanniennes caractéristiques) sont évocatrices de la présence d’une anomalie portée par ce gène. D’autres exemples de corrélations génotype-phénotype sont apportés au travers d’observations.