La neuropathie périphérique induite par la chimiothérapie (NPIC) demeure une complication fréquente des traitements anti-cancéreux, sans stratégie pharmacologique préventive efficace disponible à ce jour. Le présent travail de thèse se donne pour objectif d’exposer différentes recherches à visée translationnelle dans cette thématique, issues de collaborations cliniciens-chercheurs. A ainsi été caractérisé un modèle murin de NPIC reproduisant la neurotoxicité des immunoconjugués cytotoxiques à Auristatine. Une analyse rétrospective de nombreuses biopsies cutanées humaines, réalisées dans un contexte de suspicion de neuropathie des petites fibres, a révélé que les caractéristiques sémiologiques de la douleur, telles qu’évaluées par le questionnaire Douleur Neuropathique 4, ne reflètent pas fidèlement le risque et l’ampleur de l’atteinte des petites fibres nerveuses intraépidermiques, ce qui pourrait avoir des implications dans le cadre de futurs essais thérapeutiques. Enfin, est développé un axe de recherche neuroprotecteur visant à moduler pharmacologiquement le système rénine-angiotensine pour prévenir la NPIC, avec des premières preuves de concept chez l’Homme et une approche pharmacologique novatrice impliquant le récepteur Mas.

Le syndrome de CANVAS définie un ensemble d’entités cliniques que sont l’ataxie cérébelleuse, la neuronopathie sensitive et l’aréflexie vestibulaire, responsable conjointement ou individuellement de différents symptômes dont le plus majoritaire est un trouble de l’équilibre. De façon intéressante, il est maintenant établi que la majorité des patients présentent, des dizaines d’années avant les troubles neurologiques, une toux chronique réfractaire. En 2019, la cause génétique de ce syndrome a été décrite. Elle intéresse le gène RFC1 au sein duquel une expansion biallélique de répétitions du pentanucléotide AAGGG situé dans l’intron 2 du gène a pu être mise en cause chez les patients cliniquement atteint. Ce motif AAGGG de grande taille remplace la conformation AAAAG classiquement répétée 11 fois en population générale. La cause physiopathologique responsable de cette maladie n’est pas encore connue. Plusieurs études ont montré une variabilité de la zone répétée qu’elles soient en termes de conformations du motif qu’en termes de nombre de répétitions. Leurs implications dans la pathologie ne sont pas toujours évidentes.Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à trois axes concernant ce syndrome : (a) décrire la variabilité de la zone répétée dans une cohorte de témoins et dans une cohorte de patients adressée pour neuropathie, (b) étudier histologiquement l’atteinte nerveuse périphérique en particulier celle des petites fibres nerveuses, non décrites antérieurement, (c) étudier la prévalence de l’expansion biallélique du pentanucléotide AAGGG dans une cohorte de patients tousseurs chroniques réfractaires.Nos résultats ont permis de mettre en évidence de nouveaux motifs répétés complexes à la fois chez des témoins mais aussi chez des patients avec neuropathie. L’atteinte des petites fibres nerveuses dans le CANVAS a pu être objectivée pour la première fois. Notre étude de cohorte de 68 patients tousseurs chroniques réfractaires a permis de mettre en évidence 16% des patients porteurs d’une expansion biallélique AAGGG pathogène et nous conduit à suggérer que la toux des patients CANVAS serait une toux neurogène.L’ensemble de ces résultats de thèse a permis une avancée dans les connaissances moléculaires et physiopathologiques du syndrome de CANVAS. Des travaux complémentaires permettront de comprendre les mécanismes physiopathologiques sous-jacents afin d’envisager in fine d’éventuelles thérapeutiques personnalisées.

Les neuropathies des petites fibres (NPF), ou neuropathies douloureuses, se caractérisent par des douleurs neuropathiques et une dysautonomie, symptômes particulièrement invalidant et dont la prise en charge thérapeutique actuelle n’est pas satisfaisante. La biopsie cutanée, actuel examen « gold standard » dans le diagnostic des NPF, est un outil intéressant du fait de sa simplicité de réalisation sans séquelle, et de son accessibilité. Cependant, son interprétation actuelle est limitée, n’apportant qu’une information quantitative sur l’existence ou non d’une perte en fibres intra-épidermiques, résultante des NPF plus qu’une explication de la symptomatologie. Dans une première étude nous avons comparé la quantification des fibres de la biopsie cutanée à leur analyse fonctionnelle explorée par le SUDOSCAN®, ne retrouvant qu’une faible corrélation entre les deux outils et confirmant le mauvais reflet de la fonctionnalité des fibres dans la biopsie cutanée. De plus, dans une deuxième étude sur les patients Charcot-Marie-Tooth 1A, nous n’avons pas mis en évidence de corrélation entre la biopsie cutanée et les symptômes (sauf la sensibilité à la piqûre), soulignant une nouvelle faiblesse de cet examen. Concernant les biomarqueurs cutanées, l’analyse des cellules de Langherans dans différentes neuropathies a retrouvé une augmentation de celles-ci chez les patients diabétiques et une densité plus faible chez les sujets sains, mais également une diminution chez le patient CMT1A, sans jamais aucune corrélation avec la densité des petites fibres. Enfin, dans une troisième partie étudiant le syndrome POEMS, nous avons mise en évidence que la vascularisation cutanée, significativement plus élevée dans le POEMS, serait un biomarqueur candidat intéressant à visée diagnostique étiologique. La recherche de biomarqueurs cutanés, afin d’augmenter la puissance diagnostique, de mieux comprendre la physiopathologie de la perte en fibres pour de trouver des cibles thérapeutiques et améliorer la prise en charge de ces patients, parait essentielle. Des études supplémentaires sont nécessaires, et certaines sont en cours dans la continuité de ce travail.

L’atrésie intestinale est une anomalie congénitale définie par une perte de la continuité digestive. Malgré une restauration chirurgicale précoce de cette continuité, surviennent durant les premiers mois de vie des troubles de la motilité digestive et des surinfections bactériennes chez un tiers des patients. Ces troubles fonctionnels étaient attribués jusque là principalement à des altérations du système nerveux entérique. Le but de cette étude était de confirmer cette hypothèse mais également d’élargir le champ des explorations aux autres composants du tube digestif.Matériel et méthodesLe modèle animal de l’atrésie chez le rat initialement décrit dans notre équipe a été utilisé pour caractériser les anomalies d’expression génique par transcriptomique. L’étude portait également sur la maturation digestive chez des fœtus de rat contrôle entre un stade de développement embryonnaire E15 et E21. Des modifications en amont et en aval de l’obstruction ont été étudiées en prélevant deux segments successifs de 1 cm par cette approche globale transcriptomique puis précisées par RT-PCRq et confirmées par des techniques immunohistochimiques et de microscopie électronique. RésultatsChez les fœtus témoins, l’expression génique montre une décroissance physiologique pour le SNE et une augmentation pour les systèmes neuroendocrine et épithélial de E15 à E21. Concernant les fœtus avec atrésie, les modifications concernent quasi exclusivement le segment d’amont avec une augmentation du calibre intestinal, de l’épaisseur musculaire et une accélération globale de la maturation. Une redistribution des sous types neuronaux est constatée dans le segment d’amont ainsi qu’une augmentation de l’expression du système neuro endocrine. Pour ces deux systèmes, le segment d’aval est peu modifié. Des modifications importantes du système épithélial sont observées en amont comme en aval avec pour conséquence probable une altération de la barrière intestinale et du système anti infectieux.ConclusionCes résultats montrent que les changements prédominent dans le segment en amont de l’atrésie alors que le segment d’aval était parfois considéré comme le plus pathologique. De plus, il a été retrouvé des changements inattendus du système neuroendocrine et épithélial qui sous tendent une implication non exclusive du SNE. D’autres recherches sont nécessaires pour confirmer ces données et les exploiter dans une démarche thérapeutique.

Des modifications du gène PMP22 (Peripheral Myelin Protein 22) sont responsables de neuropathies du système nerveux périphérique : l’Hypersensibilité à la Pression (HNPP : Hereditary Neuropathy with liability to Pressure Palsy) lorsqu’il est délété, CMT1A (Charcot-Marie-Tooth type 1A) lorsqu’il est dupliqué et CMT1E ou HNPP lors de mutations ponctuelles. Cependant, le rôle de la protéine PMP22 dans ces neuropathies demeure obscur. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux partenaires d’interactions potentiels de PMP22 : l’intégrine α6β4 (un récepteur des laminines), pourrait être impliqué dans le CMT1A. Dans cette étude, nous avons utilisé un modèle de rat transgénique portant des copies supplémentaires de PMP22 de souris. Chez ce modèle, nous avons mis en évidence des variations d’expression génique des intégrines, ainsi qu’une mauvaise localisation cellulaire de celles-ci. Ces variations des niveaux d’expression des intégrines sont les témoins d’un retard de la maturation des cellules de Schwann myélinisantes, expliquant la diminution de l’épaisseur des gaines de myéline, observée chez les rats CMT1A. Dans un second temps, nous avons étudié le cas particulier d’un patient sans expression de PMP22, en raison de deux mutations composites sur les deux allèles de PMP22. Nous avons observé que l’absence de PMP22 chez l’homme entraine une absence complète de myéline due à un blocage de l’initialisation de la myélinisation lors de la formation du mésaxone. Dans un troisième temps, nous avons effectué une étude comparative de modèles animaux et de patients atteints de CMT1A / 1E et d’HNPP permettant de valider l’utilisation de tels modèles dans l’étude de ses neuropathies. Enfin, nous nous sommes intéressés d’un point de vue informatique à la structure tridimensionnelle de différentes protéines dont PMP22 grâce à la dynamique moléculaire. Ce modèle tridimensionnel de PMP22 est le point de départ de l’étude des mutations ponctuelles ainsi que des interactions de PMP22 avec son environnement. Grâce aux animaux modèles et à l’étude de patients, nous avons montré le rôle indispensable de PMP22 dans l’initialisation de la myélinisation ainsi que son effet sur les intégrines dans le CMT1A. L’utilisation de modèles informatiques tridimensionnels créés de PMP22 permettra de comprendre les effets des mutations ponctuelles sur sa structure, et ses interactions.

La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est une pathologie neurologique affectant le système nerveux périphérique. Bien que décrite à la fin du XIXème siècle, la découverte d’une anomalie génétique n’a été identifiée chez ces patients que dans les années 1990 (duplication du gène PMP22). Depuis, de nombreux gènes ont été incriminés, et leur nombre ne cesse d’augmenter. Ainsi, cette multitude de gènes nous incite à rechercher des corrélations phénotype-génotype qui permettent d’orienter au mieux le diagnostic et la prise en charge de ces patients. Comme nous le montrons au travers de nos travaux, il est possible de s’appuyer sur des données cliniques, biologiques, électrophysiologiques (voire radiologiques) et histo-pathologiques (biopsie de nerf) pour orienter la recherche d’anomalies génétiques. Pour illustrer ceci, nous nous sommes appuyés sur l’exemple des mutations du gène INF2, gène récemment associé à la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Dans ce cas précis, l’atteinte rénale, le profil électrophysiologique (forme « intermédiaire » de CMT) et surtout les données histo-pathologiques (la biopsie de nerf permettant de retrouver la présence d’expansions schwanniennes caractéristiques) sont évocatrices de la présence d’une anomalie portée par ce gène. D’autres exemples de corrélations génotype-phénotype sont apportés au travers d’observations.
 

La synthèse de la gaine de myéline périphérique par les cellules de Schwann dans le système nerveux périphérique est sous le contrôle de plusieurs facteurs de transcription incluant Egr2 qui est aussi impliqué dans la maintenance de la myéline périphérique. Nous avons développé une nouvelle méthode pour étudier l’implication de différents gènes dans la maintenance de la myéline périphérique en utilisant des siRNA pour inactiver des gènes cibles in vitro et in vivo. Nous avons utilisé des siRNA modifiés pour inhyber les gènes candidats sans utiliser de réactif de transfection. Ces siRNA sont d’abord utilisés sur des co-cultures organotypiques de ganglions rachidiens postérieurs d’embryons de rat et aussi en les injectant dans le nerf sciatique de rat adulte. Nous avons montré que les siRNA contrôles n’entrainent pas de démyelinisation significative aussi bien sur les co-cultures que in vivo après l’injection directe dans le nerf sciatique. Nous avons alors montré que les siRNA anti Egr2 régulent à la baisse l’expression de ces gènes cibles d’environ 60%. En plus, le traitement avec les siRNA anti Egr2 entrainent une dégradation de la gaine de myéline périphérique dans les co-cultures. L’injection des siRNA anti-Egr2 dans le nerf sciatique de rat adulte induit une demyelinisation rapide et significative marquée par la perte de l’expression de MPZ (myelin protein zero) dans la zone d’injection montrée par les expériences immunohistochimiques (microscopie optique) et par l’observation directe de la démyelinisation à l’épon sur des sections transversales de nerf sciatique ( microscopie optique et électronique). Ces résultats confirment ceux précédents impliquant Egr2 dans la maintenance active de la myéline qui avaient été obtenus par des expériences de « Knockout » conditionnels sur des souris. Des injections des siRNA anti-dicer ont induit de manière similaire la démyelinisation de nerf sciatique, établissant que l’expression de Dicer dans les nerfs périphériques adultes est nécessaire pour la maintenance correcte de la myéline. Nos résultats constituent une preuve de concept de l’utilisation de siRNA pour comprendre les mécanismes moléculaires de la maintenance de la myéline in vivo et les gènes induisant la démyelinisation dans les nerfs périphériques.

L’existence de douleurs neuropathiques et/ou de perte de la sensibilité douloureuse sont souvent le reflet d’une neuropathie sensitive affectant plus particulièrement les fibres nerveuses sensitives amyélinique Aδ et C, dites neuropathie des petites fibres (NPF). Ces fibres innervent, notamment, le derme et l’épiderme de la peau. Elles communiquent la sensibilité thermique et algique au système nerveux central et contribuent à l’homéostasie cutanée, entre autres, par la libération de neuropeptides en périphérie. De nombreuses pathologies sont associées à une altération de ces petites fibres dans la peau. Deux pathologies impliquant une NPF ont été étudiées au cours de ce travail : les escarres et la maladie de Charcot-Marie-Tooth type 1A. Un travail expérimental a été réalisé chez la souris pour répondre à la question suivante ; est-ce qu’une seule atteinte des fibres nociceptives, responsables de la perte de sensibilité peut entraîner un déséquilibre de l’homéostasie cutanée, responsable de l’apparition des escarres ? La mise en place d’un modèle de neuropathie sensitive fonctionnelle réversible a permis de mettre en en évidence l’implication des neuropeptides, substance P (SP) et « calcitonin gene-related peptide » (CGRP), libérés par les fibres nerveuses cutanées, dans la formation d’ulcères de pression. Un traitement préventif à la rhEPO (Recombinant Human Erythropoietin) dans ce modèle associant une neuropathie et des plaies de pression, protège la peau contre une pression ischémiante induisant une escarre par son effet neuroprotecteur sur les petites fibres cutanées. L’association CMT1A et NPF a été étudiée à partir de biopsies cutanées humaines. La quantification des fibres intraépidermiques révèle que 48% des patients CMT1A sont atteints d’une NPF. L’analyse des biopsies cutanées révèle également une altération du nombre et de la morphologie de cellules de Langerhans dans la maladie de CMT1A. L’ensemble de ces résultats confirme l’intérêt de l’étude des petites fibres dans des pathologies variées et confirme le potentiel thérapeutique neuroprotecteur de l’EPO.