Pôle Spectrométrie de masse


Le pôle de spectrométrie de masse dispose d’outils permettant de caractériser (identification et quantification – relative ou absolue) des petites molécules et des protéines.

Emilie PINAULT

Ingénieure d'Etudes, Responsable technique

Alexis MAILLEAU

Technicien

Pierre MARQUET

PU-PH, Référent scientifique

L’extraction des composés est une étape clé.

Qu’ils s’agissent d’analyses de petites molécules ou de protéines, les composés doivent être extraits selon des techniques spécifiques à chaque échantillon :

Les petites molécules sont extraites par extraction liquide-liquide ou sur phase solide (SPE) selon leurs caractéristiques physico-chimiques.

            

Les protéines sont extraites par des tampons spécifiques à partir de cellules, tissus ou fluides biologiques d’origines variées (humain, animal, végétal), avec la possibilité d’effectuer du fractionnement.

Les contaminants (sucres, lipides, …) des échantillons protéiques sont éliminés par précipitation ou par SPE.

Il est possible d’enrichir les échantillons protéiques via deux techniques différentes :

La déplétion de 2 à 6 protéines majoritaires (Albumine, IgG-IgA, Transferrine, Haptoglobine, Antitrypsine) de fluides biologiques humains.

Le kit ProteoMiner permet l’enrichissement en protéines via la saturation des billes pour les protéines majoritaires et via la concentration des protéines les plus faiblement exprimées tout en conservant leur dynamique d’abondance dans l’échantillon biologique.

Il est également possible d’effectuer du fractionnement des protéines basé sur leurs propriétés physico-chimiques :

L’isoélectrofocalisation hors-gel permet de séparer en phase liquide les protéines et les peptides selon leur point isoélectrique.

L’électrophorèse mono- et bidimensionnelle permet de séparer sur gel SDS-PAGE des protéines selon leur masse moléculaire (1D) ou selon leur point isoélectrique et leur masse moléculaire (2D).

LC-Triple Quadrupole et MicroLC-QTOF

=> Mesure de masse exacte : suggestion de formules brutes avec une précision inférieure à 20ppm

=> Acquisition de profil de fragmentation = « empreinte digitale » du composé

puis comparaison avec les bases de données publiques

=> Caractérisation d’isomères et de molécules proches par leur temps de rétention et leur profil de fragmentation

A partir de gels SDS-PAGE ou d’échantillons en phase liquide, avec ou sans fractionnement préalable.

Etape n°1 : digestion des protéines avec la trypsine pour obtenir des peptides de 5 à 25 acides aminés environ

Etape n°2 : analyse par spectrométrie de masse microLC-QTOF

=> Couplage micro chromatographie liquide avec spectromètre de masse Triple TOF 5600+ haute résolution.

=> Analyse DDA (Data Dependent Acquisition) : fragmentation de 50 peptides maximum par cycle

=> 30 min à 2h d’analyse selon la complexité de l’échantillon

=> Une analyse de 2h = 10 à 15 000 peptides fragmentés

Etape n°3 : interprétation des données

-> Intégration directe du fichier d’acquisition dans le logiciel ProteinPilot avec deux stratégies d’identification : Mascot ou Paragon

Mascot

Paragon

-> Obtention de listes regroupant les protéines identifiées dans l’échantillon, à valider manuellement

-> Utilisables pour la création de librairies de protéines pour les études protéomiques quantitatives.

La Méthode Multiple Reaction Monitoring (MRM) permet de quantifier de façon sensible et spécifique un ou plusieurs composés dans un échantillon complexe, qu’il s’agisse de petites molécules ou de protéines.

Il faut, au préalable, étudier la fragmentation des composés à quantifier et sélectionner 2 ou 3 fragments représentatifs les plus intenses pour chaque composé,

puis générer une liste de couples masse du composé > fragment (appelé transition Q1>Q3) qui sont intégrés dans la méthode.

Lors de l’analyse, le spectromètre de masse va scanner les masses des composés entrant dans le spectromètre et ne fragmenter que ceux présents dans la liste de transitions (valeur Q1). Les fragments générés seront à leur tour scannés et il y aura acquisition de données uniquement lorsque l’un des fragments de ce composé est présent dans la liste (valeur Q3).

L’aire sous la courbe de chacun des pics obtenus est mesurée par les logiciels de retraitement MultiQuant ou Analyst. Cette valeur est quantitative et est utilisée pour des quantifications absolues (avec gamme étalon) ou relatives (par rapport à une référence).

Exemple : détection d’un peptide dans un extrait protéique complexe (plasma)

Deux stratégies différentes de protéomique quantitative différentielles sont mises en place sur la plateforme :

L’iTRAQ (isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation) est une méthode permettant d’identifier et de quantifier simultanément jusqu’à 4 (iTRAQ 4-PLEX ) ou 8 (iTRAQ 8-PLEX) conditions différentes.

Après digestion des protéines, les groupements amines latéraux et terminaux des peptides sont marqués par des tags isobares, 1 tag par condition.

Les différents échantillons marqués sont regroupés et analysés par spectrométrie de masse microLC-QTOF.

Lors de la fragmentation, les ions rapporteurs sont libérés et servent à quantifier chaque peptide de chaque condition.

Le reste du spectre MS/MS est utilisé pour identifier la séquence du peptide via les bases de données, et ainsi obtenir une liste des protéines identifiées avec l’information de quantification associée.

La quantification SWATH permet d’obtenir des informations quantitatives pour toutes les protéines présentes dans une librairie protéique.

La librairie est constituée de l’ensemble des protéines représentatives des échantillons. Pour chaque protéine, sont listés les peptides spécifiques (masse m/z et temps de rétention) et pour chaque peptide, les fragments (m/z et intensité relative).

L’acquisition des données SWATH est effectuée en mode DIA (Data-Independent Acquisition) : à chaque cycle, le spectre MS est découpé en 50 à 75 fenêtres de masse. L’ensemble des pics présents dans chaque fenêtre seront fragmentés, le spectre MS/MS acquis correspond ainsi à la somme des fragments de tous les peptides présents dans cette gamme de masse.

Puis, en comparant les données SWATH avec les données de la librairie, le logiciel PeakView/SWATH2.0 permet de ré-attribuer les fragments de chaque peptide.

On obtient donc une liste de protéines, caractérisée chacune par un ou plusieurs peptides spécifiques.

Chaque peptide est quantifié par la mesure de l’aire sous la courbe après reconstruction de l’abondance des différents fragments au cours du temps.

Une étape statistique est indispensable pour déterminer si la variation détectée est significative ou non.

Un des avantages de cette technique consiste à pouvoir ré-analyser les données SWATH acquises autant de fois que nécessaires avec des librairies différentes.

Membre des sociétés

Implication dans la formation

Cours en M2 Bio-Santé de l’Université de Limoges

Cours en M2 Chimie de l’Université de Limoges