Pôle Histologie


Le pôle histologie est une structure collaborative entre l’Université de Limoges et le service de pathologie du CHU Dupuytren.

Les techniques d’histologie permettent de mettre en évidence les structures des tissus et des marqueurs spécifiques (ADN, ARN, protéines, glucides, etc.) par le biais de réactifs chromogéniques, fluorescents ou opaques aux électrons pour l’observation optique ou électronique.

Le plateau d’histologie propose un ensemble de techniques en microscopie optique et électronique applicables en biologie végétale, animale et humaine.

 Deux modes de fonctionnement sont possibles :

  • autonome via un accès libre à certains équipements du plateau (réservation obligatoire).
  • non autonome dit « prestation » avec les demandes prises en charge principalement par les techniciennes du service de pathologie du CHU.

A la demande, les médecins du service de pathologie du CHU peuvent apporter une interprétation histopathologique des résultats obtenus.

Alain CHAUNAVEL

Ingénieur CHU, Responsable technique

Sandrine ROBERT

Technicienne

Marie Laure PERRIN

Adjointe technique

Elodie GAY, Carine GUILLOT, Laurence RICHARD, Jade WIENERBETT, Marie WINKE

Techniciennes CHU

Pr François LABROUSSE

Référent scientifique

Le plateau propose 3 types de prestations :

  • Microscopie optique
  • Microscopie électronique
  • Numérisation de lames en fond claire ou en fluorescence

Pour chacune des prestations une interprétation histopathologique, peut être demandée.

 

Pour les demandes de prestations réalisées par le plateau, un formulaire de demande de prestations est à remplir. Les prélèvements sont amenés à la réception du service de pathologie du CHU accompagnés du formulaire pour y être enregistrés. Une fois la prestation réalisée, le demandeur vient récupérer les blocs et/ou lames à la réception du service de pathologie. Pour les données numériques, le demandeur est directement contacté par le plateau (microscopie électronique et scanner de lames).

Recommandations importantes :

Les prélèvements peuvent arriver à l’état frais ou déjà fixé (formol 4%, PFA 4%, Glutaraldéhyde 2.5%).

Si les prélèvements arrivent fixés, il est impératif que le volume de fixateur soit environ 10X le volume du prélèvement et que ce dernier beigne entièrement dans le fixateur. La date et l’heure de fixation doivent être mentionnées sur chaque prélèvement.

Si les prélèvements sont des pièces opératoires, il est conseillé de prendre contact au préalable avec un pathologiste () de manière à savoir quoi prélever, en quelle quantité (nombre de blocs) et pour l’organisation du travail.

Un certain nombre d’équipements peuvent être utilisés en mode autonome par les demandeurs moyennant leur réservation sur site dédié (demandeurs internes) ou en prenant contact avec le plateau ().

Si l’utilisateur n’est pas familier avec l’utilisation d’un équipement une formation sera proposée par l’équipe technique du plateau.

Les équipements utilisables en mode autonome sont : un vibratome, un cryostat, un microtome, l’appareil de TMA et le scanner de lames.

L’inclusion en paraffine permet de protéger durablement les prélèvements et de réaliser des coupes microscopiques. Elle consiste à déshydrater les prélèvements fixés et infiltrer les tissus par de la paraffine chaude. Après refroidissement les blocs de paraffine obtenus peuvent être coupés au microtome pour la réalisation de lames (habituellement 3 à 5 µm).

L’infiltration en paraffine est réalisée par un appareil à déshydratation ASP6025 de chez LEICA. La mise en bloc est faite sur un platine d’inclusion de chez  LEICA.

ASP6025 Leica : Appareil de déshydratation et d’infiltration de paraffine

Platine d’inclusion Leica : Préparation de bloc de paraffine

Différents types de coupe peuvent être réalisées selon la nature du prélèvement et/ou la finalité des coupes.

Les coupes de tissus frais préservent la morphologie, l’activité enzymatique et la viabilité cellulaire du tissu. Les coupes sont réalisées sur un vibratome VT1200S de chez LEICA.

Les coupes de tissus congelés préservent la qualité des ADN, ARN et protéines et sont souvent utilisées pour la préparation de copeaux avant extraction de ces composants. Les coupes sont réalisées sur un cryostat CM 1860 UV de chez LEICA.

Les coupes de tissus inclus en paraffine permettent l’application d’un grand nombre de techniques ; colorations standards, coloration spéciales, immunohistochimie, hybridation in situ. Les extractions des ADN et des ARN sont également possibles à partir de ces coupes. Les coupes sont réalisées sur un microtome RM2245 de chez LEICA.

Les tissus inclus en résine sont destinés aux techniques de microscopie électronique (voir section  Microscopie électronique). Les coupes sont réalisés sur un Ultra Cut UC7 de chez LEICA.

Vibratome Leica :Coupe de tissus frais

Ultra Cut UC7 Leica : Coupe de tissus inclus en résine

CM1860 Leica : Coupe de tissus congelés

Microtome Leica : Coupe de tissus inclus en paraffine

La préparation de Tissue Micro Array (TMA) consiste à mettre sur un seul bloc paraffine (bloc receveur) des zones d’intérêt de plusieurs prélèvements inclus en paraffine (blocs donneurs) ; cette approche offre une homogénéité des résultats des techniques appliquées aux coupes facilitant ainsi l’interprétation des résultats et une économie de réactifs.

Les TMA sont préparés sur un Tissue Arrayer MiniCore 3 de chez EXCILONE à l’aide du logiciel TMADesigner2 pour la création des plans de plaque.

Tissue Arrayer MiniCore 3 EXCILONE et logiciel TMADesigner2 : Préparation de TMA

Les colorations standards permettent de mettre en évidence les principales structures tissulaires et cellulaires (fibres conjonctives, cytoplasme, noyaux, nucléus). Ces colorations accompagnent généralement la création de blocs en paraffine.

Les coloration standards sont réalisées sur un bac de coloration Tissue Tek de chez SAKURA.

Tissue Tek SAKURA : Automate de colorations standards

Le plateau dispose d’un catalogue de plus de 15 colorations spéciales permettant de mettre en évidence différentes fibres conjonctives, les membranes basales, les dépôts d‘amylose, les glucides complexes (glycogène, glycoprotéines, glycolipides,) dépôt de Fer (Fe3+) et microorganismes.

Les colorations spéciales sont réalisées sur un automate Artisan Link Pro de chez AGILENT.

Artisan Link Pro Agilent : Automate de colorations spéciales

Le plateau dispose d’un catalogue de plus de 140 anticorps dirigés contre des cibles protéiques humaines directement utilisables en immunohistochimie ou immunofluorescence.

Les techniques sont réalisées sur des automates BenchMark Ultra de chez VENTANA.

BenchMark Ultra Ventana : Automate d’IHC et IF

La numérisation des lames colorées permet la conservation des résultats et leurs analyses. Elle est réalisée sur un scanner NanoZoomer RS2.0 de chez HAMAMATSU avec un grossissement de X20 ou X40 (jusqu’à X80 en numérique) et la possibilité d’empilement de couches (Z-Stack). Le scanner effectue des numérisations en fond clair et en fluorescence. Pour la fluorescence, le scanner est équipé d’un module de fluorescence avec un jeu de filtres optimisés pour la numérisation du Dapi/Fitc/Tritc/Cy5.

Les images sont stockées temporairement par le plateau et peuvent être récupérées sur clé USB par le demandeur en même temps que le logiciel de visualisation NDPView ; ce logiciel offre les possibilités d’un microscope virtuel avec annotation des images, mesures des structures, etc.. Les images peuvent être converties en formats TIF et JPEG.

NanoZoomer RS2 Hamamatsu : Scanner fond clair et fluorescence

La microscopie électronique est l’équipement de choix pour obtenir des images à haute résolution des tissus et des cellules. Des éléments spécifiques peuvent être mis en évidence par des techniques immuno-gold.

Les prestations sont réalisées avec un microscope électronique JEM-1011 JEOL avec un pouvoir de résolution d’environ 4.5 Å. Les images sont enregistrées par une caméra CCD MORADA G3 de 16 mégapixels. Une analyse morphométrique peut être réalisée sur demande.

JEM-1011 JEOL : Microscope électronique