Pôle Acides nucléiques


Le pôle d’analyse des acides nucléiques, bi-site, est une structure collaborative entre l’Université de Limoges et le CHU Dupuytren, en particulier avec son Unité de Séquençage UF8843. Ce pôle  regroupe un panel  d’outils et de techniques permettant l’analyse des acides nucléiques à des fins de séquençage, de génotypage et d’étude d’expression. Les analyses sont majoritairement automatisées et effectuées dans un environnement contrôlé répondant aux enjeux scientifiques actuels en terme de recherches académiques, cliniques et privées.

Emilie GUERIN

Ingénieure CHU, Responsable technique

Lionel FORESTIER

Ingénieur d'Etudes, Responsable technique

Valentin TILLOY

Ingénieur CHU, Interface production - gestion de données

Sophie ALAIN

PU-PH, Référente scientifique

La fragmentation des acides nucléiques ARN/ADN constitue en autre l’étape initiale quasi indispensable pour la fabrication de librairies avant séquençage.

Le bioruptor pico et le Covaris M220 sont des sonicateurs de paillasse. De 1 à 16 échantillons peuvent être traités simultanément. Différentes tailles de fragmentation peuvent être obtenues par réglage du temps et de la puissance de sonication.

Bioruptor Pico

Covaris M220

Les dosages (quantitatifs et qualitatifs) des acides nucléiques s’effectuent en routine sur le pôle pour différentes applications et notamment le séquençage NGS.

Le spectrophotomètre Nanodrop 1000 et surtout le fluorimètre Qubit 2.0 pour les vérifications de librairies NGS constituent les appareils de prédilections pour les dosages quantitatifs des acides nucléiques.

Le bioanalyser 2100 qui est un système microfluidique d’électrophorèse est particulièrement requis pour l’estimation de la pureté (pour les ARNs à travers principalement la notion de RIN) et du « sizing » des acides nucléiques.

Nanodrop 1000

Qubit 2.0

Bioanalyser 2100

Le Biomek NXp Span8 est un automate de pipetage (format 1 colonne microplaque 96) associé à un bloc de thermocyclage qui prend en charge la préparation des librairies NGS de type Ion Torrent et Illumina. Actuellement, 4 protocoles sont disponibles : AmpliSeq (Ion Torrent) – NimbleGen Kappa – TruSeq mRNA (Illumina) – MedIP Seq.

Pour des applications ADN/ARN  liées à la bactériologie ou à la virologie, le Library Builder est utilisé dans la préparation de librairies (Ion Torrent).

BiomeckNXp Span8

Library Builder

Les séquenceurs 3130xl et 3500xlDx basés sur l’analyse d’ADN marqués par fluorescence lors d’une électrophorèse capillaire prennent en charge le séquençage Sanger et l’analyse de fragments.

Le pyroséquençage réalisé avec le Pyromark Q24 permet la génération de séquences courtes pour en autre l’analyse de SNP (24 échantillons).

séquenceurs 3130xl et 3500xlDx

Pyromark Q24

* Le pôle dispose des 2 technologies de séquençage NGS :

Pour la technologie Ion Torrent, un Ion Proton et un S5 basé sur l’approche séquençage « postlight » offrent  des possibilités de séquençage de l’ordre de 3 à 80 M de reads de 200pb. Le proton permet de générer en moyenne 10 à 15 Gb de données. Ces deux séquenceurs sont environnés d’un One Touch2 et d’un Ion Chef pour prendre en charge la préparation des puces.

Ion Proton

S5

One Touch2

Ion Chef

Puce

Pour la technologie Illumina, un Miseq et un NextSeq 500 offrent différentes possibilités de séquençage avec des capacités allant de 300 Mb à 150 Gb, de 1 M à 400 M de reads et des longueurs jusqu’à 2*300 pb (Miseq).

Miseq

NextSeq 500

* De plus le séquençage de troisième génération est abordé à travers la technologie Oxford Nanopore sur le séquenceur MinION. Celui, à travers l’utilisation de protéines naturelles que sont les Nanopores, permet l’obtention de 10 Gb de données composées de séquences longues (4,5 à 60 Kb) sans biais d’amplification.

* La technique de QPCR est disponible  à travers le QuantStudio 12k qui repose sur l’emploi d’assays Taqman. Cette approche de PCR en temps réel, basée soit sur le format TLDA soit sur le format OpenArray, se positionne pour des analyses ciblées à moyen débit de transcriptome et de génotypage.

* L’appareil QX200 de droplet digital PCR (ddPCR) permet des analyses de PCR quantitative absolue en émulsion (sonde et EvaGreen).

* Le GeneAtlas est un système robuste (bas débit) de microarray appliqué à la transcriptomique et basé sur la technologie d’Affymetrix.

QuantStudio 12k

QX200

GeneAtlas

Le pôle gère le stockage sécurisé des données sur différents serveurs en fonction du type d’analyse avec un volume total qui se rapproche actuellement des 500 To.

Un travail d’analyse qualitative est délivré à travers l’édition systématique des rapports de runs et l’étude qualité  (couverture, profondeur,…).

Applications :
  • Whole génome (petits génomes)
  • Séquençage ciblé (amplicons, capture)
  • Transcriptome
  • Exome
  • MedIP Seq, ChIP Seq
  • Métagénomique
Exemples :
  • Caractérisation diagnostique et théragnostique des cancers par séquençage selon la technologie Ion Proton (Ampliseq)
  • Analyse du transcriptome du pin Douglas
  • Caractérisation de variants impliqués dans la maladie de Charcot-Marie-Tooth (Ampliseq)
  • Etude de l’émergence des résistances aux antiviraux en population (séquençages de produits de PCR)
  • Recherche d’intégrons comme marqueur de résistance aux antibiotiques dans différents environnements
  • Caractérisation de la nature de l’environnement génétique (chromosomique/plasmidique) d’intégrons (MinION)
  • Dépistage prénatal non-invasif des trisomies 13, 18 et 21 fœtales (DPNI)
  • Variants EBV et pouvoir pathogène