Réaliser le diagnostic d’une Amylose


Le diagnostic de certitude de l’amylose AL est anatomopathologique, il est donc nécessaire d’obtenir un prélèvement, si possible par une biopsie peu invasive (glandes salivaires accessoires, graisse abdominale sous-cutanée, peau lésée) sinon par biopsie d’un organe atteint (rein, foie, cœur, rectum, tractus gastro-intestinal) après contrôle du bilan de coagulation et en informant le pathologiste de la suspicion d’amylose. L’examen anatomopathologique doit permettre de typer la maladie de dépôt. Cependant il est parfois difficile d’obtenir un typage précis en routine (anticorps particuliers non disponibles dans tous les centres), aussi dans le cadre du centre de référence nous vous proposons de nous adresser des prélèvements biopsiques pour une aide au typage lorsque celui-ci n’a pas pu être effectué. La microscopie électronique constitue une technique complémentaire nécessitant une infrastructure spécifique et un personnel hautement qualifié. Malgré un coût non négligeable, elle apporte des informations précieuses, qualitatives et quantitatives, sur l’organisation interne des cellules et des tissus, complétant l’étude histopathologique standard, en immunohistochimie et/ou en immunofluorescence.

Du microscope photonique au microscope électronique

Le microscope photonique permet de visualiser des structures de l’ordre d’une centaine de microns par l’intermédiaire des photons Le microscope électronique fait franchir plusieurs ordres de grandeur grâce à l’utilisation des électrons permettant ainsi de visualiser des structures de l’ordre du nanomètre. La résolution d’un microscope est définie par la distance minimale séparant deux points individualisables, plus petite est cette dimension, meilleure est la résolution. La résolution est directement proportionnelle à la longueur d’onde du faisceau incident. On a une résolution de l’ordre de 10-7 m pour une d’onde correspondant à la lumière visible et de l’ordre de 10-12 m quand on utilise un faisceau d’électrons. En biologie, cela nous permet d’obtenir des images de bonne qualité grossies jusqu’à 200.000 fois.

Le Microscope électronique en transmission (MET)

Le microscope électronique en transmission (MET) est utilisé en anatomie pathologique, aussi bien pour obtenir des informations en vue du diagnostic que pour la recherche. Il donne des images en deux dimensions et permet de visualiser l’architecture cellulaire et tissulaire.

gif_Microscope

Le MET comporte plusieurs éléments : Le canon à électrons contient la source d’électrons qui sont émis par effet thermo-ionique, en chauffant un filament de tungstène. Pour contrôler la trajectoire des électrons, on utilise le champ magnétique induit par des lentilles électromagnétiques. Les lentilles condenseurs permettent d’obtenir des conditions d’illumination optimales, la lentille objectif agrandit l’image de l’objet,celle-ci est reprise par les lentilles intermédiaires et projectifs qui l’agrandissent encore. Les électrons viennent ensuite frapper un écran fluorescent , sous cet impact sont produits des photons. Au niveau de la préparation, les électrons incidents provenant de la source pourront être :

  • arrêtés par le diaphragme de contraste
  • ou transmis

et ils exciteront alors un écran fluorescent.Les électrons arrêtés se traduisent à l’observation par des zones sombres. Les électrons transmis correspondent à des zones claires. Une image est ainsi créée en différents niveaux de gris.

Préparation des échantillons

  • Fixation

Elle doit être réalisée le plus rapidement possible après le prélèvement et sur des blocs de petite taille (1 à 2 mm3) afin que la fixation soit homogène. Une double fixation est réalisée : dans le glutaraldéhyde (dialdéhyde) à 4% pendant deux heures minimum ou dans une enceinte à micro-ondes. Ce fixateur crée des pontages homogènes et irréversibles entre les différents groupements aminés des protéines. Cependant il ne réagit pas du tout avec les lipides, on complète donc la fixation par le tétraoxyde d’Osmium qui ouvre les doubles liaisons des lipides insaturés, il réagit donc bien avec les phospholipides des membranes et les triglycérides. On procède par immersion du prélèvement dans des piluliers en verre contenant le fixateur correspondant au matériel à fixer, sous hotte aspirante. On va ensuite accélérer la fixation par chauffage dans une enceinte à micro-onde, provoquant une réticulation des protéines tissulaires. Pour se faire, on dépose le prélèvement dans un tube en verre, immergé dans le fixateur, ce tube est alors déposé dans un bécher rempli d’eau (100mL), à la puissance de 700W, jusqu’à atteindre une température de 37° C. Le prélèvement est ensuite rincé trois fois en tampon phosphate salin.

  • Inclusion

Processus de substitution de l’eau des tissus par une résine monomère dont la polymérisation contrôlée permet d’obtenir un bloc dur. Elle doit être suffisamment rapide pour préserver l’intégrité des tissus. La plupart des résines sont hydrophobes : une déshydratation préalable est donc indispensable pour leur permettre de pénétrer dans les tissus. La déshydratation des tissus se fait à l’aide d’agents de déshydratation miscibles à l’eau (acétone), en concentration croissante :

    • Acétone 50% 2x 1min
    • Acétone 70% 2×5 min
    • Acétone 90% 2x15mn
    • Acétone 100% 4x15min

Puis on remplace le dernier bain de déshydratation par un demi mélange de résine et de solvant (acétone avec l’Araldite). Les milieux d’inclusion à base de résines époxy (Araldite) permettent la conservation d’une morphologie optimale et sont faciles à préparer ; ils ne nécessitent que trois produits : la résine Araldite, le durcisseur anhydre DDSA et l’accélérateur amine le DMP-30

  • Coupes semi-fines :

Elles permettent de se repérer en visualisant la surface de l’échantillon. Le bloc est préalablement taillé au pyramitome. La surface d’attaque ne doit pas contenir de milieu d’enrobage, mais doit conserver l’échantillon dans sa totalité. On effectue des coupes d’une épaisseur de 1µm qui sont récupérés dans une goutte d’eau et déposées sur une lame de verre, mises à chauffer sur une platine à 80°C. On colore rapidement la lame au bleu de toluidine (seul colorant passant à travers la résine) ,on identifie alors la zone d’intérêt pour l’observation au microscope électronique

  • Coupes Ultrafines :

Des coupes très minces (60-70 nm) sont réalisées à l’aide d’un ultramicrotome à partir du bloc préalablement sélectionné à partir des coupes semi-fines, en microscopie photonique. Les coupes sont récupérées sur des grilles (en cuivre ou en nickel). L’épaisseur approximative des coupes ultrafines obtenues est déterminée par leur couleur en effet, la longueur d’onde de la lumière (couleur) réfléchie par les coupes est fonction de leur épaisseur. Couleurs de réflexion des coupes en fonction de leur épaisseur (en nm) Gris <60 Argent 60-90 Or 90-150 Mauve 150-190 Bleu 190-240 Vert 240-280 Jaune 280-320

  • Imprégnation métallique des coupes

Pour augmenter la différence de transmission des électrons, et donc renforcer le contraste, on doit marquer sélectivement les structures avec des atomes lourds, faisant obstacle aux électrons. On utilise l’association d’acétate d’uranyle (produit radioactif donc à manipuler derrière des briques de plomb) qui se fixe surtout sur les structures riches en ADN) et de sels de plomb (se déposent sur les structures membranaires et cytoplasmiques). Les coupes ultrafines sont observées au microscope électronique de type JEOL 1010. - Temps de technique : 4 jours

Coût d’un examen en microscopie électronique

Le coût d’un microscope électronique est de l’ordre de 350.000Euros. Les charges, comprenant les consommables et le contrat d’entretien, sont de 40.000 Euros à l’année. Le coût d’un examen en ME peut être évalué à 400 Euros.

Exemples d’immunomarquage en MET

Les clichés suivants présentent deux coupes de glomérules, révélés par un antiserum et marqué avec billes d’or. Le premier cliché, à gauche est le témoin. Aucun marquage n’est observé, il n’y a donc pas d’amylose AL. Le second cliché, à droite est positif, révélant des dépots d’amylose répartis sur l’ensemble de la coupe.

 gif_GlomeruleALmoins gif_GlomeruleALplus

Cette différence est encore plus marquée sur les clichés suivants :

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Pour plus d’information sur les examens réalisés par le centre de référence amylose AL, cliquez sur ce lien.